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    1. 蘇州安泰凈化工作臺在一種簡單、經濟、高效的大量肝細胞培養方法中

      一種簡單、經濟、高效的大量肝細胞培養方法

      1材料與方法
      1.1 實驗材料 昆明種封閉群乳小鼠由瀘州醫學院 動物科提供。DMEM培養基、新生小牛血清均購于 Hvclone公司。堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、過碘酸(AR) 均為上海試劑廠生產。二氧化碳培養箱(98008444,U. S.A),超凈工作臺SW-CJ-1F蘇州安泰空氣技術有限公司),倒置顯微鏡(XST—D,重慶光學儀器廠),超 純水儀(Maxima型,英**)。
      1.2 方法
      1.2.1 肝組織塊的獲得與培養取1~3 d的乳小鼠 5只,于超凈工作臺內消毒,剖腹,取出肝組織,切割 為約l mm3的碎塊、PBS(10 mmol/L,pH7.4)清洗,然 后移入玻璃離心管內。用眼科剪剪碎**糊狀,加入5 倍體積的0.1%胰蛋白酶,置37℃下消化10 min,其間 不時振搖。然后靜置待組織塊沉淀,棄上清液,Hanks 液洗組織塊2次,以除去血細胞及其他細胞;**后再 用少許10%小牛血清DMEM培養液洗1次,以充分終 止酶的活性。在消化好的肝組織塊內加少許培養液, 混勻后平均轉移于5個培養瓶(50 mL)內,使組織塊 均勻分布,置37℃、5%CO:孵箱內孵育3 h,組織塊貼 壁后再補加10%小牛血清培養液4 mL/瓶,繼續培養, 每兩天換培養液1次,并觀察細胞生長情況。
      1.2.2肝細胞的傳代培養 大約6~7 d肝細胞長滿 瓶底,即可傳代。倒去原培養液,加消化液(0.25%的胰 蛋白酶,O.02%的EDTA)覆蓋瓶底,倒置顯微鏡下見細 胞變圓(約3。5 min),立即倒掉消化液,加10%小牛 血清培養液洗1次.再加10%小牛血清培養液4 mL 輕輕吹打約3 min后。靜置使組織塊沉淀,轉移上層 細胞懸液于另一干凈培養瓶繼續培養。每兩天換培養 液1次。并繼續觀察細胞生長情況。 原培養瓶去除組織塊后,于倒置顯微鏡下見有散 在細胞貼附于瓶底.多為梭形、三角形、星形等變形細 胞.采用PAS染色法【z】對原培養瓶內殘留細胞進行染 色.大多細胞胞質中未見粉紅色糖原顆粒,核呈空泡 狀。繼續采用H.E復染胞核,可見空泡狀的核染成紫 藍色,未見有雙核細胞(圖la,本文照片見封三)。
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